Клишина И. И.: Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Часть II. Глава 2.

ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

Диссертация
на соискание учёной степени
Автор:

КЛИШИНА ИННА ИВАНОВНА

ВЛИЯНИЕ ТРУТНЕВОГО РАСПЛОДА
НА АКТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ
НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ
ПРИ ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

 

Часть II.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГОМОГЕНАТА И ЛИОФИЛИЗАТА ТРУТНЕВЫХ ЛИЧИНОК

Объектами исследования являлись гомогенат трутневых личинок (ГТЛ) и лиофилизат трутневых личинок (ЛТЛ) итальянской, карпатской и помесной породы – серой горной кавказской и карпатской, отобранные в июне-июле месяце с пасек Краснодарского края, Ставропольского края и Ростовской области. Трутневый расплод отбирали от сильных, хорошо перезимовавших, обеспеченных кормами пчелиных семей в 6-7 – дневном возрасте (перед запечаткой ячеек восковой воздухонепроницаемой крышечкой). Личинки из ячеек извлекали с помощью шпателя. Для производственных целей данную операцию проводили путем прессования сот с личинками. Полученную массу гомогенизировали миксером и фильтровали протиранием гомогенизата через капроновое сито с размером отверстий не более 0,1 мм для удаления микрочастиц личиночной оболочки и остатков пыльцевых зерен. Из-за высокой лабильности ГТЛ хранили при температуре от -5 до -10° С.

Лиофилизированный гомогенат трутневых личинок получали путем обезвоживания гомогената из замороженного состояния. Для этого нативный гомогенат замораживали на 2-3 часа при температуре минус 35-40° С. Далее из замороженного состояния производили сублимацию в вакууме при остаточном давлении 0,1-0,6 мм. рт. ст. в течение 40-48 часов, доводя температуру к концу сушки до +25-30 С. Остаточная влажность обезвоженного гомогената составляет 1-3%. Камеру, оборудование и упаковочную тару предварительно стерилизовали 75% этиловым спиртом. Ввиду высокой гигроскопичности лиофилизата его хранили при температуре +7° С. По внешнему виду лиофилизат трутневого расплода предсталяет собой порошок желтого цвета.

На кафедре токсикологической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии доцентом Д.С. Лазаряном из гомогената трутневых личинок получены две фракции – гидрофобная и гидрофильная, которые условно названы «липидной» и «белковой». «Липидная» фракция получена трехкратной экстракцией эфиром, «белковая» – последующим осаждением водной фракции центрифугированием (15 минут при 6000 об/мин) [80].

 

2.2. ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ И ПОСТАНОВКА ОПЫТОВ

Исследования проводили на белых беспородных крысах обоего пола весом 180 – 220 г, белых мышах обоего пола весом 20 – 25г, содержащихся в стандартных условиях вивария Пятигорской государственной фармацевтической академии.

При изучении гепатопротекторного действия трутневого расплода и его отдельных фракций, в основном, использовали модель острой токсической гепатопатии, индуцированной тетрахлорметаном [96]. Повреждение печени при данной интоксикации обусловлено токсическими метаболитами тетрахлорметана, которые действуют на цитохром Р450-зависимую монооксидазу, расположенную в гладкой эндоплазматической сети перивенулярных гепатоцитов [2, 167, 171]. Модель позволяет определить наличие и выраженность защитного эффекта средств к воздействию гепатотоксина, включая некоторые часто назначаемые в клинической практике лекарственные средства, имеющие сходный с тетрахлорметаном механизм поражения печени. Кроме того, активация перекисного окисления липидов, индуцируемая метаболитами тетрахлорметана и составляющая основу повреждения печеночной паренхимы [2, 31, 85,171] играет важную роль и при ряде широко распространенных заболеваний, таких как ИБС, атеросклероз, лучевая болезнь и др., что позволяет косвенно оценить возможность назначения изучаемых средств и при этих заболеваниях.

Схема эксперимента предусматривала проведение следующих серий опытов, каждая из которых включала 8 животных:

• группа интактных животных;
• контрольная группа, животным которой внутрижелудочно вводили 50%- ный масляный раствор четыреххлористого углерода в дозе 0,3 мл на 100 г массы животного трехкратно через день [96];
• опытные группы животных в течение 14 дней получали свежеприготовленную водную суспензию гомогената трутневых личинок в дозах 13, 50 и 200 мг/кг или лиофилизата трутневых личинок в дозах 50 и 100 мг/кг интрагастрально, а на 10-ый, 12-ый и 14-ый дни через 2 часа после приема трутневого расплода 50%-ный вводился масляный раствор тетрахлорметана в дозе 0,3 мл на 100 г массы животного.

В качестве препаратов сравнения использовали официальное гепатозащитное средство – лив-^2 (производства НУМАЬАУА ОЯАС СОМРАМ, Индия), который вводи¹ и в аналогичных условиях в виде водной взвеси в дозах 13 и 50 мг/кг внучрижелудочно в объеме 1 мл водного раствора на 100 г массы тела животного, а также препараты – прополис (ЗАО «НПО АПИКА», Россия) и апилак (АО «Таллинский фармацевтический завод», Эстония) в дозах 13 и 50 мг/кг [93,139].

В части исследований использовали модель токсической гепатопатии, вызванной двухнедельным введением изониазида в дозе 200 мг/кг; параллельно животные получали ГТЛ в дозах 50 и 200 мг/кг.

В конце эксперимента животных декапитировали, из цельной крови готовили мазки для изучения фагоцитоза, а в полученной из крови сыворотке определяли комплекс биохимических и иммунологических показателей.

Часть животных подвергали эвтаназии хлороформом для проведения гистоморфологических исследований аутоптатов печени.

Основные серии экспериментов

Весь комплекс исследований по изучению влияния трутневого расплода на функциональное состояние печени и активность факторов естественного иммунитета при острой интоксикации выполнен на 584 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-220г. Серии проведенных опытов, методы и количество животных представлены в таблице 1.

Таблица 1 № п/п Цель эксперимента Определяемые показатели Количество животных 1 2 3 4 1 Изучение острой токсичности пчелиного расплода Острая токсичность 24 2 Изучение гепатотоксичности ЛТЛ Продолжительность нембуталового сна 36 3 Изучение аллергенности ЛТЛ Гистамин крови Показатель повреждения нейтрофилов Гемолиз эритроцитов Циркулирующие иммунные комплексы 18 4 Изучение влияния ЛТЛ, прополиса, апилака и лив-52 нп активность факто- ров неспецифн – ской резистентно- сти у здоровы ‘ПцЧНЫХ Бактерицидная активность сыворотки крови Лизоцим сыворотки крови р-лизины сыворотки крови Фагоцитарная активность нейтрофилов крови 40 5 Изучение влияния ЛТЛ, прополиса, апилака и лив-52 на показатели функционального состояния печени у здоровых животных Активность аланинаминотранс- феразы в сыворотке крови Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови Холестерин печени Гликоген печени Белок печени Нуклеиновые кислоты печени 40

 

Продолжение табл.1 1 2 3 4 6 Изучение влияния ГТЛ на показатели функционального состояния печени при тетрахлормета- новой интоксика­ции Активность аланинаминотранс- феразы в сыворотке крови Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови Общий билирубин сыворотки крови Холестерин печени Триглицериды печени Гликоген печени 32 7 Изучение влияния ГТЛ на показатели функционального состояния печени при изониазидовой интоксикации Активность аланинаминотранс- феразы в сыворотке крови Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови Общий билирубин сыворотки крови Холестерин печени Гликоген печени 32 8 Изучение влияния ГТЛ на показатели неспецифической резистентности при тетрахлорметановой интоксикации Бактерицидная активность сыворотки крови Лизоцим сыворотки крови Р-лизины сыворотки крови Фагоцитарная активность нейтрофилов крови 32 9 Изучение влияния ГТЛ на показатели неспецифической резистентности при изониазидовой интоксикации Бактерицидная активность сыворотки крови Лизоцим сыворотки крови Р-лизины сыворотки крови Фагоцитарная активность нейтрофилов крови 32 10 Изучение влияния ЛТЛ на показатели функционального состояния печени при тетрахлормета­новой интоксика­ции Активность аланинаминотранс- феразы в сыворотке крови Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови Общий билирубин сыворотки крови Холестерин печени Триглицериды печени Гликоген печени 32 11 Изучение влияния ЛТЛ на показатели неспецифической резистентности при тетрахлорметановой интоксикации Бактерицидная активность сыворотки крови Лизоцим сыворотки крови Р-лизины сыворотки крови Фагоцитарная активность нейтрофилов крови 32

 

Продолжение табл. 1

1	2	3	4
12	Изучение влияния различных продук­тов пчеловодства и лив- 52 на показате­ли функционально­го состояния пече­ни при тетрахлор- метановой интокси­кации	Активность аланинаминотранс- феразы в сыворотке крови Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови Общий билирубин сыворотки крови Холестерин печени Триглицериды печени Гликоген печени	40
13	Изучение влияния различных продук­тов пчеловодства и лив- 52 на актив­ность факторов не­специфической ре­зистентности при тетрахлорметановой интоксикации	Бактерицидная активность сыворотки крови Лизоцим сыворотки крови Р-лизины сыворотки крови Фагоцитарная активность нейтрофилов крови	40
14	Изучение сравни­тельного влияния ГТЛ, его «белко­вой» и «липидной» фракций на показа­тели функциональ­ного состояния пе­чени при ССЦ-ин- токсикации	Активность аланинаминотранс- феразы в сыворотке крови Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови Общий билирубин сыворотки крови Холестерин печени Триглицериды печени Гликоген печени	40
15	Изучение сравни­тельного влияния ГТЛ, его «белко­вой» и «липидной» фракций на показа­тели естественного иммунитета при ССЦ-интоксикации	Бактерицидная активность сыворотки крови Лизоцим сыворотки крови [5-лизины сыворотки крови Фагоцитарная активность нейтрофилов крови	40
16	Изучение влияния трутневого распло­да на анаболические процессы	Определение белка и нуклеиновых кислот в печени	32

 

Продолжение табл.1 1 2 3 4 17 Изучение влияния трутневого распло­да на накопление продуктов ПОЛ при ССЦ-интоксикации Определение уровня ТБК-актив- ных продуктов в сыворотке крови 48 18 Изучение влияния трутневого распло­да на гистоморфо- логическую карти­ну печени Окраска аутоптатов печени гематоксилинэозином для получения обзорных препаратов и суданом-Ш для выявления жиров Определение количества жировых клеток в поле зрения и характер жировой дистрофии 42

 

2.3. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

• Определение острой токсичности

Определение острой токсичности проводили на беспородных белых мышах обоего пола массой 10 – 20 г методом Кербера [5] с учетом рекомендаций фармакологического комитета по изучению общетоксического действия фармакологических средств [110].

• Определение гепатотоксичности

Гепатотоксичность выбранных доз определяли по продолжительности нембуталового сна у крыс по Гацура В.В. [27]. За сутки до введения этаминала натрия животным per os однократно вводили лиофилизат трутневых личинок в дозах 13, 50, 100 мг/кг и гомогенат трутневых личинок в дозе 200 мг/ кг в виде водной суспензии в объеме 1 мл на 100 г массы тела. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Ровно через сутки всем группам животных вводили этаминал натрия (нембутал) в дозе 30 мг/кг. Регистрировали время засыпания каждого животного и время пробуждения. Результаты опытов сравнивали с группой животных, получивших физиологический раствор в эквивалентном объеме и нембуталовый наркоз.

• Определение активности аланинаминотрансферазы сыворотки крови

Активность аланинаминотрансферазы определяли с помощью набора реактивов фирмы “LACHEMA” (Чехословакия), по методу Райтмана и Френкеля, который основан на колориметрическом определении интенсивности окраски гидразона пировиноградной и оксоглутаровой кислот, образовавшихся в щелочной среде при добавлении к выделившейся в ходе ферментативной реакции пировиноградной кислоте 2,4-дифенил-гидразона [65]. Результаты выражали в мккат/л.

• Определение активности щелочной фосфатазы сыворотки крови

Активность щелочной фосфатазы устанавливали по методу V. Chromy, V. Kulhanek, J. Ficher с помощью набора реактивов фирмы “LACHEMA” (Чехословакия), принцип которого основан на спектрофотометрическом определении 4-нитрофенола, освобожденного в процессе расщепления щелочной фосфогидролазой 4-нитрофенилфосфата в 1Ч-метил-В- глюкаминовом буфере [76]. Результаты выражали в мккат/л.

• Опрееление общего билирубина сыворотки крови

Содержание общего билирубина в сыворотке крови определяли с

помощью набора реактивов «КлиниТест-Bil» (г. Санкт-Петербург) по методу Jendrassik L., Cleghorn R. Метод основан на способности билирубина реагировать с диазотированной сульфаниловой кислотой в присутствии кофеиноврого реактива с образованием окрашенного азобилирубина, который определяется фотоколориметрически. Количество общего билирубина выражали в мкмоль/л [76].

• ТБК-активные продукты сыворотки крови

Определение вторичных продуктов перекисного окисления липидов проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой с использованием диагностического набора “Биоконт, Агат”. Принцип метода основан на том, что продукты перекисного окисления липидов образуют с тиобарбитуровой кислотой окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом, интенсивность которого, измеряемая на СФ-46 при длинах волн 535 и 575 нм, пропорциональна концентрации вторичных продуктов перекисного окисления липидов. Результаты определения выражали в мкмоль/л [176].

23 Л.Спонтанный гемолиз по Ягеру

Метод основан на определении при 540 нм экстинции внеэритроцитарного гемоглобина, поступающего в среду вследствие спонтанного лизиса мембран эритроцитов, вызванного пероксидным окислением липидов кислородом воздуха [144]. Результаты выражали в %.

• Определение гликогена в печени

Содержание гликогена в ткани печени устанавливали методом количественного определения с помощью фенола и серной кислоты; количество гликогена выражали в г/кг [97].

• Определение холестерина в печени

Определение холестерина в печени проводили после извлечения диэтиловым эфиром после щелочного гидролиза и последующим колориметрическим определением по цветной реакции Либермана-Бурхарда на КФК-2 при длине волны 630-690 нм [68]. Расчет проводили по стандарту, результаты выражали в г/кг.

• Определение триглицеридов в печени

Определение триглицеридов проводили стандартным набором “LACHEMA” после извлечения их аналогично извлечению холестерина [68]. Расчет проводили по стандарту, результаты выражали в мкмоль/г.

• Определение общего белка печени

Определение белка проводили спектрофотометрически в гомогенате печени, полученного путем гомогенизации навески печени с физиологическим раствором, учитывали разницу экстинций при 260 и 280 нм, и рассчитывали по формуле, эмпирически полученной Колькаром:

Х=1,45*Е₂₈о-0,74*Е₂бо                   (1)

Результаты выражали в мг/г [138].

2.3.12. Определение нуклеиновых кислот в печени Определение нуклеиновых кислот проводили спектрофотометрически в гомогенате печени, полученном путем гомогенизации навески печени с 0,2 М хлорной кислотой, по разнице экстинкций при 270 и 290 нм [97].Результаты выражали в мг/г.

2.4. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

 2.4.1 Определение активности лизоцима в сыворотке крови

Определение активности лизоцима в сыворотке крови проводили нефелометрическим методом [34] по лизису тест культуры Micrococcus lysodeictikus. Процент активности вычисляли по разнице процента светопропускания испытуемой смеси после инкубации и процента светопропускания исходной смеси, который составляет 20%. % активности = D – 20%, (2) где D – процент светопропускания исследуемой пробы после инкубации.

2.4.2. Определение активности ß-лизинов в сыворотке крови

Активность ß-лизинов в сыворотке крови определяли ускоренным нефелометрическим методом [11] по редукции оптической плотности испытуемой смеси с культурой Bacillus subtilis 83 до и после инкубации. Литическую активность выражали в процентах активности. Расчет проводили по формуле: % активности = (Д, – ДО * 100 / (К_ГК₂) (3) где Д1 – оптическая плотность опытных проб до инкубации Да – оптическая плотность опытных проб после инкубации Ki – оптическая плотность контрольных проб до инкубации К₂ – оптическая плотность контрольных проб после инкубации. 2A3.Определение бактерицидной активности сыворотки крови

2.4.3. Определение бактерицидной активности сыворотки крови

Проводили фотонефелометрическим методом [12] по разнице процента гибели суточной культуры E.coli О 111 в контрольной пробе с физиологическим раствором и опытной пробе, содержащей сыворотку. Процент активности вычисляли по формуле % активности =(ОД контроля – ОД опыта) * 100 / ОД контроля (4) где ОД – оптическая плотность.

2.4.4. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов крови

Фагоцитарную активность нейтрофилов крови проводили по методу Иванова А.И. и Чухловина Б.А. [39,40], основанного на инкубации гепаринизированной крови с миллиардной взвесью Е. Coli в мясопептонном бульоне с последующим выделением с помощью центрифугирования лейкоцитарной массы и приготовления из неё фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазков на предметном стекле. В мазке считают 100 клеток и производят расчет показателей фагоцитоза: показатель фагоцитарной активности лейкоцитов (ФАЛ) – процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, от общего их числа; процент завершенности фагоцитоза (ПЗФ) – число клеток с завершенным фагоцитозом на 100 сегментноядерных нейтрофилов, участвующих в фагоцитарной реакции; фагоцитарный индекс лейкоцитов (ФИЛ), индекс Райта, – среднее число фагоцитированных микробов на один нейтрофил.

2.4.5. Определение циркулирующих иммунных комплексов

Определение циркулирующих иммунных комплексов проводили по методике В. Гашковой с соавт.[157], основанной на способности раствора полиэтиленгликоля осаждать из сыворотки крови иммунные комплексы; изменение плотности раствора регистрировали на спектрофотометре при длине волны 250 нм и выражали в единицах оптической плотности.

2.4.6. Определение процента повреждения нейтрофилов

Метод определения ППН основан на инкубации смеси крови с исследуемым аллергеном, к которому предполагают наличие сенсибилизации организма, и цитратом натрия с последующим приготовлением мазков крови, где с помощью иммерсионной микроскопии подсчитывают количество поврежденных нейтрофилов в опыте (Н₀) и контроле (Н_к) [64].

2.4.7 .Определение гистамина в сыворотке крови

Определение гистамина в крови проводили по Н.В. Климкиной и С.И. Плитману [144]. Метод основан на взаимодействии между гистамином и диазотированным п-нитроанилином с образованием соединения оранжево- красного цвета. Расчет проводили по стандарту, результаты выражали в мкмоль/л.

2.5.ГИСТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Гистоморфологическое исследование проводилось у тех же крыс, у которых изучались биохимические показатели в крови и ткани печени после двухнедельного введения исследуемых веществ с последующим созданием модели токсической гепатопатии. Аутоптаты печени фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Использовали следующие методы окраски: гематоксилин-эозином (для получения обзорного препарата); Суданом III (для выявления жиров); ШИК-реакция (для выявления гликогена и
гликопротеидов). Определяли количество жировых клеток в поле зрения и характер жировой дистрофии печени [130]. Характер распределения и накопления гликогена в клетках печени оценивали в каждом гепатоците полуколичественным методом в баллах по сравнению с интактными животными. Поле зрения ограничивалось окулярной сеткой. Критерии оценки: отсутствие окраски – 0 баллов; очень слабое окрашивание – 1 балл; слабое окрашивание -2 балла; умеренное окрашивание – 3 балла; сильное окрашивание – 4 балла. Описывались изменения в общей морфологической картине печени с учетом данных Логинова А.С [84].

2.5. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты опытов обрабатывались методом вариационной статистики [4]. Для определения достоверности количественных различий результатов опытов, проведенных на разных группах животных, вычисляли среднее арифметическое (М) и среднюю ошибку среднего арифметического (ш). Из значений Мит определяли коэффициент Стьюдента (X).

На основании величины t и числа наблюдений по таблице показателей существенной разницы (t) определяли вероятность различия (р).

Существенными считали результаты при величине вероятности различия не менее р<0,05 (пакет программ «MS Excel» 2000).

 

 

1. Клишина. И.И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Оглавление.
2. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Введение.
3. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации.  Часть I. Обзор литературы.
4. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Часть I. Глава 1. Продукты пчеловодства. Общая характеристика и применение.
5. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Часть II. Собственные исследования.
6. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Часть II. Глава 2. Материалы и методы собственных исследований.
7. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации.  Часть II. Глава 3. Исследование фармакологической активности продуктов пчеловодства у интактных животных.
8. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. . Часть II. Глава 4. Влияние гомогената трутнвых личинок на функциональное состояние печени и неспецифическую резистентность при тетрахлорметановой и изониазидовой интоксикации.
9. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Часть II. Глава 5. Влияние лиофилизата трутневых личинок на функциональное состояние печени и неспецифическую резистентность при тетрахлорметановой интоксикации.
10. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Часть II. Глава 6. Сравнительное влияние различных продуктов пчеловодства и официального гепатопротектора на функциональное состояние печени и неспецифическую резистентность при тетрахлорметановой интоксикации.
11. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Часть II. Глава 7. Некоторые стороны механизма действия трутневых личинок при тетрахлорметановой интоксикации.
12. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Общее заключение и выводы.
13. Клишина И. И. Влияние трутневого расплода на активность факторов неспецифической резистентности и функциональное состояние печени при острой интоксикации. Список литературы..