«Исследование функциональной активности личинок трутней» — магистерская диссертация ученого Ду Ингана. Работа исследует свойства трутневого расплода или гомогената, пытаясь найти для него место в медицинской практике. На этой стезе сегодня в Поднебесной трудятся сотни талантливых биологов и медиков. В Китае же свойства личиной трутней исследуются с начала 60-х годов.
Несмотря на малопонятное название, эта диссертация представляет значительный интерес для широкого круга читателей, поскольку опирается на тысячелетний опыт китайской медицины и современные достижения науки. Книга вобрала в себя данные об исследованиях трутневого расплода, проведенных в Юго-Восточной Азии за последние полвека. Результаты работы китайских ученых вдвойне интересны, если учесть, что КНР в 21 веке вышла в лидеры среди пчеловодческих стран. Именно там сегодня сосредоточено наибольшее количество пчелиных семей, есть много фирм, производящих трутневый расплод и маточное молочко.
Промышленный и культурный прорыв Китая сегодня вызывает восхищение, как европейцев, так и американцев. Вероятно, эта страна в ближайшем будущем будет диктовать правила и в сфере продукции для здоровья. Мы уже рассказывали про работу биолога Мяо Сяоцина, посвященную влиянию трутневого гомогената на активность раковых клеток. Теперь вы можете познакомиться с магистерской диссертацией его ученика Ду Ингана.
Содержание
Синтез древних секретов врачевания и современной медицины. Лекарство долголетия небожителей
Внимание китайских ученых к этому ценному апипродукту вполне закономерно. Традиции прошлого не только хранятся, но и преумножаются в Поднебесной. Автор работы цитирует знаменитый «Трактат о корнях и травах» императора-мудреца Шэнь-нуна, называвшего личинки трутней «лекарством долголетия небожителей». С подачи этого писателя в древнем Китае трутневый расплод использовали для «поднятия самочувствия и укрепления Ци», «лечения мигрени». Поэтому неудивительно, что целебный продукт долгое время был непременным атрибутом на столе китайских правителей. С начала 21 века в этой стране был взят курс на синтез древних секретов врачевания и современной медицины. Вероятно, этим и объясняется необычный подход автора диссертации к изучению свойств трутневого расплода.
Любопытный факт —ученый применяет личинки трутней совместно с лекарством древней китайской медицины. При этом биолог нашел такое соотношение компонентов, которое оказывает наибольшее лечебное воздействие. Через всю научную работу нитью проходит мысль о том, что трутневый гомогенат является идеальным продуктом питания и средством для оздоровления организма.
Автор диссертации уверен, что свойства трутневого расплода обусловлены его уникальным химическим составом. В личинках трутней содержатся основные витамины, восемь наиболее важных для человека аминокислот. Это глютамин, аспарагин, аланин, пролин, лейцин, лизин и другие. Биолог пришел к выводу, что все аминокислоты в расплоде содержатся в «правильных пропорциях и очень легко могут быть усвоены организмом человека». Кроме того, в значительных количествах в трутнях обнаружены ювенальный гормон и экдизон. Поэтому можно лишь согласиться с утверждением автора, что гомогенат — идеальное средство для поддержания здоровья организма и достижения долголетия.
Значение научной работы китайского исследователя
На наш взгляд основное значение научной работы Ду Ингана в том, что этот биолог глубоко проник в механизм действия трутневого расплода на иммунную систему. В своей диссертации он представил значительное количество аргументов в пользу того, что расплод активирует все три вида иммунитета: неспецифический, клеточный и гуморальный. Подробно описываются аминокислоты, ненасыщенные жирные кислоты, благотворно влияющие на защитные силы организма. В частности, показан процесс воздействия комплекса аминокислот расплода на способность макрофагов к синтезу микротрубочек и микрофиламентов.
Также подчеркивается, что энтомологические гормоны расплода обеспечивают восстановление молекул МНС второго и третьего класса. Это семейство генов или часть генома, которая имеет огромное значение для функционирования иммунной системы. Установлено, что способность расплода активизировать иммунитет позволяет использовать его и как средство для сдерживания раковых заболеваний.
Значение этой научной работы заключается также в том, что получены очередные доказательства действия трутневого гомогената по уменьшению усталости, снижению фактора стресса. Это свойство продукта пчеловодства было известно и ранее, благодаря чему стало возможным производство биодобавок с трутневым расплодом для спортсменов.
Нельзя обойти вниманием и крайне интересные данные, полученные китайским исследователем в ходе эксперимента над грызунами. К примеру, описывается действие расплода трутней на уровень молочной кислоты в крови, азота мочевины в сыворотке крови, содержание гликогена в печени. Отметим, что полисахарид гликоген, накапливающийся в печени, является важным источником энергии при физической нагрузке. Если организм атлета накопил достаточное количество этого вещества, то его выносливость будет высокой.
Диссертация китайского биолога будет полезна всем, кто интересуется перспективами применения апипродуктов и новыми способами лечения тяжелых заболеваний.
Фуцзяньский университет НУНЛИНЬ.
Магистерская диссертация
Исследование функциональной
активности личинок трутней
Специальность:
Профилактика вредных насекомых в сельском хозяйстве
Специализация:
Использование полезных насекомых и глубокая переработка
Аспирант: Ду Инган
Научный руководитель: преп. Мяо Сяоцин
Дата завершения: апрель 2004 года
Dissertation for Master Degree of Fujian Agriculture and Foresty University
Studies on the Function and Activation of Honeybee Drone Larvae
Specialty: Agricultural Insects and Pest Control
Study field: Beneficial Insects Utilization and Deep Process
Name: Du Ying-gang
Supervisor: Prof. Miao Xiao-Qing
Finished at: Apr,2004
Содержание
Реферат……………………………………………………………………………………………… 4
Реферат на английском языке………………………………………………………………. 7
1 Предисловие……………………………………………………………………………………. 6
2 Материалы и методы……………………………………………………………………… 17
2.1 Материалы………………………………………………………………………………. 17
2.2 Реагенты, применяемые в испытаниях………………………………………… 17
2.3 Используемое измерительное оборудование………………………………. 18
2.4 Метод проведения испытания……………………………………………………. 19
2.5 Статистический метод……………………………………………………………….. 35
3 Результаты и анализ……………………………………………………………………….. 35
3.1 Определение содержания влаги…………………………………………………. 35
3.2 Испытание на пищевую безопасность…………………………………………. 36
3.3 Испытание на сопротивление усталости и стрессу……………………….. 41
3.4 Исследование регуляции иммунной функции……………………………… 48
3.5 Исследования, направленные на определение более точной наилучшей дозировки личинок трутней…………………………………………………………………………….. 53
3.6 Поиск наилучшего соотношения личинок трутней и лекарства китайской медицины……………………………………………………………………………………………………… 56
3.7 Исследование наилучшей дозировки смеси личинок трутней и лекарства китайской медицины (при доле лекарства китайской медицины равной 30%)…….. 58
4 Краткий итог…………………………………………………………………………………. 62
Используемая литература………………………………………………………………….. 68
Приложение……………………………………………………………………………………… 73
Благодарность………………………………………………………………………………….. 74
Реферат
Личинки трутней возрастом 10 дней являются не только лишь отличным питательным продуктом, но и хорошим оздоровительным препаратом из сферы пчеловодства. В приведённых испытаниях, основной задачей является предварительное определение содержания воды для обеспечения точности дозировок, необходимых при проведении последующих испытаний пищевой безопасности, и аргументирования посредством исследований согласно порядка оценки и методов экспериментальной проверки функций личинок трутней, способствующих повышению сопротивления усталости, стрессу, укрепления иммунитета, улучшения других функций организма, а также определения максимально эффективной дозировки путём проведения испытаний на мышах. Одновременно с этим, согласно принципа «государь, министр, их помощники и посланцы» (прим. перев.: четыре категории лекарств, применяемых в китайской медицине – главные и второстепенные (вспомогательные)) стоит задача подбора рецептуры препарата, содержащего личинки трутней и лекарство китайской медицины для максимального раскрытия всего лечебного потенциала личинок трутней. После чего, посредством испытаний, определить наилучшее соотношение этих компонентов и дозировку смеси благодаря которым удастся достичь максимальной эффективности при их использовании.
Испытание на пищевую безопасность: испытания на острую токсичность проводятся при проектных дозировках по методу Хорна (Horn method). Суть метода заключается в достижении максимальной дозировки равной 100 г/кг, посредством многоразового употребления образца испытуемыми в течение 24 часов. Результаты данного испытания следующие: в группе испытуемых употреблявших личинки трутней в чистом виде, группе, употреблявшей лекарство китайской медицины и группе, употреблявшей смесь личинок трутней и лекарства китайской медицины, смертей обнаружено не было. Однако, при максимальной дозировке лекарства китайской медицины у испытуемых было зафиксировано снижение веса. После произведения вскрытия, отклонений от нормы обнаружено не было. Результаты исследования генотоксичности исследуемого образца, посредством микроядерного испытания и анализа аберраций сперматозоидов показали, что личинки трутней и смесь личинок трутней и лекарства китайской медицины являются полностью безопасными. При максимальной дозировке лекарства китайской медицины равной 20 г/кг, обнаруживается генетическая токсичность, однако в соответствии с положительным контролем, данная токсичность является крайне незначительной.
Проведение испытаний на измерение показателей гликогена печени, лактатдегидрогеназы, азота мочевины сыворотки крови, содержания молочной кислоты в крови, а также определение показателей удержания мышей на жерди и испытаний плаванием с целью оценки влияния личинок трутней на повышение способности организма к сопротивлению усталости. Результат испытания показал, что личинки трутней обладают особой функцией, способствующей высокоэффективному повышению сопротивлению усталости. Даже минимальные концентрации в 0,25 г/кг чётко демонстрируют эффективность в повышении способности организма к сопротивлению усталости. Наиболее эффективной дозировкой для повышения сопротивления усталости определена дозировка равная 3,65 г/кг. Оценка влияния личинок трутней на сопротивляемость мышей стрессу посредством определения влияния высоких и низких температур на время жизни испытуемых мышей. Посредством данного метода, было определено, что личинки трутней способны повысить сопротивляемость стрессу. Наиболее эффективной дозировкой является дозировка 3,8 г/кг. Посредством испытания с плаванием мышей и сравнением полученных показателей, было определено, что наилучшее отношение дозировок личинок трутней и лекарства китайской медицины достигается при части лекарства китайской медицины в смеси равной 36,2%. Смесь личинок трутней и лекарства китайской медицины (доля лекарства китайской медицины в смеси составляет 30%), при дозировке 3,06 г/кг имеет наилучшую эффективность в повышении сопротивляемости усталости.
Использование метода измерения веса органов иммунной системы, испытаний с поглощением перитонеальными макрофагами мышей эритроцитов петуха (интравитальный метод), метода отёка уха (DTH) и метода CRBC для определения содержания гемолизина в сыворотке крови с целью оценки влияния личинок трутней на неспецифический иммунитет, иммунитет на клеточном уровне и гуморальный иммунитет. Результаты показали, что личинки трутней способны заметно повысить иммунитет испытуемых мышей. Результат заметен уже при очень низких дозировках. Наиболее оптимальной дозировкой была определена дозировка равная 3,62 г/кг. Использование показателей клеточного иммунитета полученных посредством применения метода отёка уха (DTH) позволило определить наиболее оптимальную долю лекарства китайской медицины в смеси личинок трутней с лекарством китайской медицины, которая составила 29,7%. Смесь этих компонентов (доля лекарства китайской медицины составляет 30%), при дозировке 3,08 г/кг обеспечивает наилучший результат в плане усиления иммунитета у мышей.
Испытание наилучшего соотношения личинок трутней и лекарства китайской медицины показало, что выбранное лекарство китайской медицины способно заметно усилить эффективность личинок трутней при повышении сопротивляемости усталости и усилении иммунитета у испытуемых мышей. Среди всех испытанных дозировок, в дозировках, где доля лекарства китайской медицины занимает 20%-50% смеси, при проведении испытания с определением максимального времени плавания мышей, были получены очевидные результаты, свидетельствующие о большей эффективности применения смеси по сравнению с применением личинок трутней в чистом виде. В испытании гиперчувствительности замедленного типа (DTH) вызванной динитрофторбензолом (DNFB), при доле лекарства китайской медицины равной 20%-30%, наблюдается заметное отличие показателей от показателей, полученных при проведении исследования, в котором применялись личинки трутней в чистом виде.
Анализ взаимосвязи показателей продемонстрировал присутствие чёткой взаимосвязи между показателями времени плавания при определении сопротивляемости усталости и показателями, полученными в результате проведения других испытаний. Между показателями степени отёка уха, полученными в результате испытания направленного на определение иммунитета методом гиперчувствительности замедленного типа (DTH) вызванной динитрофторбензолом (DNFB) и другими показателями иммунитета имеется чёткая взаимосвязь.
ABSTRACT
Drone larvae of ten days age are not only a kind of good nourishments but also a kind of good substance for bee therapy and health care. Firstly, I had test the accurate content of water in drone larvae in order to confirm the accurate dosage. Secondly, I took their safety as food into experiment. Thirdly, I did many experiments on their function of anti-fatigue and antiHiyperirritability and immunity enhancement. Through these experiments I had figured out the best dosage for these uses. I also found the combination drone larvae and Chinese herbal medicine can make their function repaired with each other. I experimented out the best ratio between them and the best dosage of the mixture in which contains 30 percent Chinese herbal medicine.
Safety as food experiments: Acute toxin experiments, four dosages were selected: 10.0g/kg, 21.5g/kg, 46.4g/kg and 100g/kg, giving them to mice within 24hours, 12hours of feeding prohibition of them before experiments. The reaction and the death information of the mice were observed. The result shows that drone larvae and Chinese herbal medicine and their mixture have no acute negative effect to mice. Inheritance toxin experiments, Chinese herbal medicine is not safe as drone larvae and their mixture. But it is toxin only when the dosage is as high as 20.0g/kg. All these demonstrate that drone larvae and Chinese herbal medicine and their mixture are safety enough as nourishments.
The time of swim, the time of climbing pole, lactic acid of blood, blood serum urea nitrogen, lactic acid dehydrogenation enzyme, glycogen of liver are investigated to appraise anti-fatigue. Result shows drone larvae are good on anti-fatigue and low dosage such as 0.25g/kg also has the effect on anti-fatigue. The best dosage is 3.65g/kg. The death time when mice were placed in high or low temperature conditions were used to measure the effect of drone larvae on anti-hyper irritability. The best dosage is 3.8g/kg. The time of swim was investigated to appraise anti-fatigue of the mixture that made of drone larvae and Chinese herbal medicine. Result shows when Chinese herbal medicine has 36.2 percent in the mixture can make drone larvae have the best function on anti-fatigue. The best dosage is 3.06g/kg.
The weight of immunity apparatus, experiment of phagocytosis of macyophage，DTH and the value of blood serum hemolysin were investigated to appraise Nonspecific immunity, Cellular immunity and Humoral immunity. Result shows that drone larvae can markedly enhance immunity function in mice. They have effect even with low dosage and the best dosage is 3.62g/kg. DTH was investigated to appraise Cellular immunity of drone larvae and Chinese herbal medicine’ s mixture. Result shows when Chinese herbal medicine has 29.7 percent in the mixture can enhance their immunity function the best and the best dosage is 3.08g/kg.
The experiments in finding the best ratio of drone larvae and Chinese herbal medicine show that the Chinese herbal medicine can badly enhance drone larvae7 s effect on anti-fatigue and immunity function in mice. The result is better than only using drone larvae when the mixture contains 20%-50% Chinese herbal medicine in the experiment of mice’ s swim. In the case of DTH the percentage of Chinese herbal medicine is 20%-30%,
Correlation analysis shows there has a good relativity between the time of swim and the other anti-fatigue indexes. DTH and the other immunity indexes also have good relativities.
1 Предисловие
1.1 Введение
Вместе с повышением объёмов производств вследствие индустриализации и ростом населения земного шара, влияние отработанных газов, воды, отходов и других выбросов на здоровье людей и состояние окружающей среды с каждым днём заставляет обращать на себя всё больше внимания мировой общественности. Стремление к натуральным и здоровым продуктам питания захлёстывает весь мир. Этот процесс будет продолжаться ещё довольно длительное время. XXI век – это век натуральной и здоровой пищи. Личинки и куколки медоносной пчелы – это пищевой продукт для поддержания здоровья организма данный человечеству самой природой. С целью утоления голода и, как следствие – выживания, люди древних времён охотились за личинками и куколками диких пчёл различных видов. Отсюда берет своё начало процесс одомашнивания медоносных пчёл. Было проведено множество испытаний и изысканий различных методов производства и технологий хранения личинок и куколок медоносных пчёл. Каждое из мировых государств проводило исследования по изучению питательных компонентов, содержащихся в куколках и личинках медоносной пчелы, занималось разработкой технологий их использования, а также изучением фармакологической активности и механизма их воздействия на организм. Данное направление получило широкое распространение. В частности, очень популярными стали разработки и исследования личинок и куколок пчелиной матки и трутня. Таким образом, был создан фундамент для научного применения этого драгоценного ресурса.
1.2 Общее ситуация в изучении и исследовании личинок трутней
1.2.1 История исследований личинок и куколок
В местах, откуда берут своё начало развитие и существование каждого из мировых государств и каждой нации, по наследству передаётся множество описаний обычаев и записей о том, как люди древних времён охотились на диких пчёл, а также использовали их личинок и куколок в пищу. 1200 лет до нашей эры, написанный в нашей стране «Словарь Эръя» содержит следующие записи об употреблении личинок и куколок пчёл в пищу: «Земляная оса, можно питаться её детвой. Древесная оса. Также можно питаться её детвой». «Атлас по травничеству», «Ли-Цзи – правила женского поведения» и другая классическая литература также содержит записи о пищевой и лечебной ценности личинок и куколок пчёл. В 877 году нашей эры, в период династии Тан, Лю Сюньчжу в «Записках о странном на южной стороне пяти хребтов» описывает наблюдаемые им в районе Сюань (чжоу) и Шэ (чжоу) сцены сбора детвы пчёл и принесения их в качестве подарков для близких друзей: «Путешествуя по Сюань (чжоу) и Шэ (чжоу), обнаружил использование местными людьми детвы пчёл в пищу. Внешний вид их схож с куколкой шелкопряда. Цвет – перламутрово-белый. Взрослые пчёлы строят своё жилище в лесу среди гор. Внешне оно похоже на колокол. Сколько в нём сотен этажей – неизвестно. Жители деревни их собирают, сами обязательно обёрнуты в траву для защиты от ядовитых жал. Дымом разгоняют маток пчёл, затем ползут на дерево и обламывают его ветку. В одном домике около 5 доу (прим. перев.: 1 доу = 10,35 л) или 1 ши (прим. перев.: 1 ши = 10 доу) детвы. Одна треть из них – с лапками и крыльями. Остальные две трети не имеют сформированных крыльев и лапок. Они солятся и обжариваются, затем сушатся, складываются в маленькие мешочки и отправляются в столицу в качестве продукта местного производства». Из данного отрывка столь живого описания, мы можем узнать о реальных способах охоты и использовании личинок и куколок медоносных пчёл в районах Сюаньчжоу и Шэчжоу. Также, за три века до нашей эры, личинки и куколки медоносной пчелы использовались в рецептах различных лекарств. Об этом имеются чёткие записи, полученные из древних предписаний врача написанных на шёлке «Пятьдесят два рецепта для исцеления недугов», найденных во время раскопок Мавандуй в г. Чанша. В 220-250 годах нашей эры, династия Поздняя Хань, Чжан Цзи в написанном им «Трактате Шэнь-нуна о корнях и травах» относит детву пчёл (личинки и куколки медоносной пчелы) к наиболее ценным продуктам, называя их «Лекарством долголетия небожителей. Для государя. Живительная основа. Не ядовито. Не вредит человеку при длительном употреблении и употреблении в больших количествах. Для поднятия самочувствия и укрепления Ци. Долгие годы не старея. … Основа при лечении мигрени (головной боли). Долгое употребление добавит человеку глянца». В 1578 году нашей эры, Ли Шичжэнь написал «Компендиум лекарственных веществ», в котором содержаться более подробные описания физико-химических свойств и функций личинок и куколок медоносных пчёл. «Детва пчелы. Белая куколка с не полностью сформированными головой и лапками. Древние относят их к пище и с давних времён употребляют в питании. Есть три вида этих пчёл. Первый вид делает ульи в лесу, либо в ямах. Это дикие пчёлы. Другой вид содержится людьми при помощи специальной утвари. Размер их мал, цвет желтоват. Мёд красивый и густой. Третий вид делает ульи высоко в горах. Мёд белого цвета. Все три вида живут роями. Имеют матку. Матка по размерам больше чем остальные пчёлы. … (Вкус) сладкий, ровный, слегка холодит. В основном применяется при лечении головной боли, удаляет яды, восполняет пустоту. … Является основой при лечении рожистого воспаления, краснухи, остаточного жара внутри живота, женских заболеваний в нижней части живота, полезен при запорах и затруднённом мочеиспускании, снимает отёчность.» Записи о личинках и куколках медоносной пчелы в «Компендиуме лекарственных веществ» являются обобщением всех подобных общедоступных источников о лекарственных и пищевых продуктах, накопленных в нашей стране за тысячи лет. Здесь признаётся то, что личинки пчелы оказывают хорошее воздействие на восстановление у человека недостатка Ци, Сюэ, Инь и Ян, а также способствуют укреплению иммунитета, и замедлению старения организма [1-4].
1.2.2 Современная обстановка в развитии и использовании личинок и куколок медоносной пчелы.
В последнее время, одновременно с непрерывным развитием технологий по выращиванию пчёл, объёмы производства личинок и куколок медоносной пчелы непрерывно растут. Люди также постепенно начинают понимать пищевую ценность личинок и куколок медоносной пчелы. В начале 50-х годов XX века, пчеловоды зачастую относили личинок и куколок к лакомствам и деликатесам, либо использовали их для производства настоек. После употребления их в пищу, они обнаруживали усиление аппетита, улучшение сна и повышение общего тонуса организма. После 80-х годов XX века, в нашей стране уже начали появляться отдельные предприятия, занимающиеся изготовлением продукции из личинок, проводя их обработку и изготавливая на их основе спиртовые настойки, жидкости для перорального применения, а также производили их в форме порошка, используемого для поддержания здоровья. В виде порошков продукция экспортировалась за границу в виде сырья. Однако большая часть личинок и куколок по-прежнему не находила широкого использования. На рынках Европы и Японии личинки и куколки медоносной пчелы относятся к очень ценным натуральным продуктам питания, и глубоко почитаются людьми. Консервы из куколок пчелы считаются квинтэссенцией среди питательных продуктов для поддержания здоровья. Множество ресторанов даже используют куколок трутней как деликатес с изысканным вкусом [7-10]. В настоящее время, народные познания о личинках и куколках медоносных пчёл стали ещё более глубокими, а сфера их применения постоянно расширяется. Америка и Япония уже на протяжении довольно длительного периода времени изготавливают куколок трутней в форме различных пищевых продуктов и экспортируют их на международные рынки. Румыния в 80-х годах начала изготавливать на основе куколок трутня «Апиларнил», а также проводить обработку личинок трутней и производства его в форме лиофилизированного порошка для последующего комбинирования с прополисом и производством «Апиламилпропа», и других питательных и тонизирующих продуктов. Одновременно с этим, куколки пчёл также изготавливаются в форме «Питательного молочка на основе эмбрионов пчелы» и «Мороженого на основе эмбрионов пчелы». Кроме этого, куколки используются как наилучшее сырье для изготовления косметики и другой продукции [3,8].
1.2.3 Состав личинок и куколок трутней
Медоносная пчела (Honeybee) относится к насекомым с полным метаморфозом. Их развитие проходит следующие четыре стадии: яйцо (Egg), личинка (Larvae), куколка (Pupae) и имаго (Imago). Стадия личинки – это период с момента её появления из яйца и до окукливания. Особь, проходящая данный этап развития называется личинкой (Larvae of Honeybee). Стадия куколки – это период с момента окукливания до момента превращения во взрослую особь и покидания улья. Особь, находящаяся на данной стадии развития, называется куколкой (Pupae of Honeybee).
Личинки трутней формируются из неоплодотворённой яйцеклетки пчелиной матки в трутневой ячейке. Личинка трутня во время своего развития усваивает маточное молочко, пыльцу и мёд. Все эти компоненты имеют чрезвычайно высокую питательную ценность. Кроме этого, для активации и рекомбинации, эти питательные вещества должны пройти сложный химический процесс внутри тела личинки. После этого, будут произведены новые питательные и активные компоненты. Таким образом, личинки трутня имеют очень большую питательную и лекарственную ценность. Период взросления личинки трутня непосредственно перед стадией окукливания – это период, при котором личинка накапливает в себе максимальное количество питательных веществ. В этот момент тело личинки в большом количестве содержит множество питательных компонентов и физиологически активных веществ необходимых для создания различных видов тканей. Все эти питательные компоненты и физиологически активные вещества способны оказывать на организм человека разнообразные оздоровительные эффекты. Поэтому личинка, находящаяся на данном этапе развития, представляет собой идеальный пищевой продукт для питания и оздоровления организма. По причине того, что на различных этапах взросления потребляются различные вида корма, личинки трутня способны получать чистое маточное молочко только в возрасте от 1 до 3 дней. Через 3 дня жизни личинки, маточное молочко сменяется на пергу. Добавив к этому её видоизменение на других этапах развития, получается, что в зависимости от дня жизни личинки, содержащиеся в ней питательные вещества различны. Одновременно с этим, на данные различия в содержании питательных веществ также в некоторой степени влияет как сезонность, так и географическое положение. На сегодняшний день содержащиеся в личинках питательные вещества ещё не до конца изучены, в частности – некоторые молекулы активных белков. Через 7 дней после появления личинки из неоплодотворённой яйцеклетки, она переходит в стадию куколки (возраст 11-12 дней). После этого и до момента её превращения во взрослое насекомое, тело медоносной пчелы представляет собой куколку трутня. Куколка трутня – это чрезвычайно питательный продукт, богатый белком, содержащий в себе множество витаминов, и имеющий низкий уровень жиров и сахаров. В зависимости от возраста куколки, содержащиеся в ней вещества немного различны. Среднее содержание влаги в свежей куколке трутня составляет от 73,23% до 80,16%. Процент сухого вещества составляет от 19,84% до 23,64%. Сухая часть куколки содержит от 41,5% – 63,10% сырого белка, от 15,71% до 26,14% сырого жира и от 3,68% до 11,60% углеводов. Куколка трутня содержит в себе 17 различных видов аминокислот, а также калий, натрий, кальций, фосфор, магний, медь, железо, цинк, марганец и множество других минералов. Содержание этих 17 видов аминокислот изменяется одновременно с увеличением возраста куколки и трутня. В куколке возрастом 22 дня количество содержащихся аминокислот заметно выше. Не зависимо от стадии развития, и личинки и куколки трутней в достаточном количестве содержат необходимые человеческому организму 8 видов аминокислот. Среди них – глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аланин, пролин, лейцин и другие аминокислоты. Все эти аминокислоты содержатся в правильных пропорциях и очень легко могут быть усвоены организмом человека [4-13]. Содержание белка в личинках и куколках трутня выше, чем в маточном молочке, и более чем в два раза выше, чем в пыльце и говядине, уступая тем самым лишь рыбьему жиру. Содержание аминокислот в два раза выше, чем в пыльце, более чем в десять раз выше, чем в молоке и более чем в три раза выше количества аминокислот, содержащихся в говядине и куриных яйцах. Содержание необходимого для человеческого организма микроэлемента – цинка, в два раза выше по сравнению с маточным молочком и более чем в четыре раза превосходит количество цинка, содержащегося в перге. Также личинки и куколки трутня содержат в себе так называемые «духи-защитники здоровья организма человека, живущего в XXI веке» – германий, селен и другие. Личинки и куколки содержат флавоноиды, препятствующие развитию атеросклероза, снижающие количество холестерина и выполняющие функцию защиты организма от радиации. В большом количестве содержат больше десяти видов ферментов и смешанных гормонов насекомых. Кроме этого, они также содержат кальций, витамины и другие активные вещества [12-32]. Большинство содержащихся в них веществ человеческий организм не способен производить самостоятельно.
Е Чжэньшэн и другие [6] (2003), Юань Яодун и другие [10] (1999) приводят следующую информацию: личинки трутня возрастом 10 дней содержат большое количество ювенильного гормона. В зависимости от выделения ювенильного гормона системой секреции внутри организма насекомого, в начальный период развития личинки, количество циркулирующего в её крови ювенильного гормона максимально. В период сбрасывания куколки, количество ювенильного гормона в крови находится на среднем уровне. После сбрасывания куколки и формирования взрослого насекомого, концентрация ювенильного гормона в его крови опускается до нуля. Так, на 22 день развития, когда куколка трутня вот-вот превратится во взрослое насекомое, содержание ювенильного гормона крайне мало. В возрасте 10 дней – окончание стадии личинки, содержание ювенильного гормона довольно высоко. Гораздо выше чем у куколки в возрасте 22 дней. Личинки трутня возрастом 10 дней имеют высокую питательную ценность. Оценивая питательную ценность личинки трутня, опираясь на содержание лизина и его пропорций, получим: белковый скор личинки трутня возрастом 10 дней – 80,7, белковый скор личинки трутня возрастом 22 дня – 53,34. Это говорит о том, что сочетание аминокислот в организме личинки возрастом 10 дней довольно подходящее, и может быть легко усвоено и переварено человеческим организмом. В свою очередь для 22 дневной особи, усвояемость будет хуже.
Сравнение состава личинки трутня возрастом 10 дней и куколки трутня возрастом 22 дня.
| Возраст (дней) | Вес (мг) | Сухая масса (мг) | Сырой белок
(мг) |
Сырой жир
(мг) |
Углеводы
(мг) |
9 видов минералов
(мг) |
17 видов аминокислот
(мг) |
| 10 | 349,5 | 94,65 | 38,8 | 24,66 | 14,05 | 1,4266 | 28,50 |
| 22 | 258,28 | 49,27 | 31,09 | 7,76 | 1,81 | 0,872 | 24,86 |
| Для особи возрастом 10 дней выше чем у особи возрастом 22 дня на, % | 35,31 | 92,1 | 24,8 | 217,78 | 676,2 | 63,61 | 14,64 |
Мяо Сяоцин [33], в своих исследованиях гистоанатомии медоносных пчёл и их физиологического развития также придерживается данного вывода. Он полагает, что человеческим организмом лучше всего усваиваются питательные компоненты, находящиеся во взрослых личинках и личинках, период развития которых находится непосредственно перед стадией куколки.
1.3 Лекарственная ценность личинок и куколок медоносной пчелы
За последние годы применение личинок и куколок медоносной пчелы получило довольно широкое распространение. Так, помимо их использования в качестве обычных продуктов питания, корма для насекомых, корма применяемого при разведении домашней птицы и других вариантов использования, личинки и куколки медоносной пчелы начали довольно активно применяться в клинических условиях для укрепления здоровья людей. Согласно предоставляемой заграничной и внутригосударственной информации, личинки способны не только улучшать аппетит, повышать качество сна и укреплять общее состояние организма, но и осуществлять регуляцию работы центральной нервной системы, нормализовать обмен веществ и внутреннюю секрецию организма. Личинки медоносной пчелы подходят для употребления в пищу людям с ослабленным организмом, обессиленным, людям с гипотрофией, пациентам после операции, либо перенесения болезни, новорождённым, пожилым, а также людям, требующим частого получения питания для восстановления. Также они оказывают вспомогательный лечебный эффект при лечении пациентов со слабой нервной системой, ревматическим артритом, гепатопатией и лейкопенией. Как свежие куколки пчёл, так и куколки, изготовленные в форме сухого порошка, имеют хорошее соотношение глютаминовой и аспарагиновой кислот. Сумма частей этих двух типов аминокислот в обеих формах материала составляет 20%. Следовательно, они возможно являются отличным препаратом для поддержания здоровой работы головного мозга. Для большинства людей наиболее интересным является тот факт, что личинки и куколки медоносной пчелы богаты специальными смешанными гормонами, способными подавлять развитие новообразований и препятствовать раку. Среди всех этих гормонов, в наибольшем количестве содержаться следующие два типа гормонов: ювенильный гормон и экдизон. Посредством стимулирования синтеза циклической аденозинмонофосфорной кислоты, можно способствовать нормализации спирали белка, и как следствие достичь противоракового воздействия [13]. Итальянские учёные, совместно с онкологической больницей города Ханчжоу, провинции Чжэцзян (КНР) и 12 другими больницами, пероральным и инъекционным методами вводили крысам больным асцитным раком Эрлиха экстракт из куколок пчёл. Как результат была обнаружена способность последнего тормозить развитие этого заболевания. Были обнаружены регрессивные изменения раковых клеток. Это стало начальным подтверждением того, что куколки пчёл содержат специфические компоненты, способные противостоять раку [14]. В 1962 году, Яо Цыю (г. Фузцянь) опубликовал информацию об испытании на животных личинок пчелиной матки для сдерживания прогрессирования асцита. В ходе данного испытания, контрольной и опытной группам одновременно вводилась асцитная жидкость для достижения чёткой симптоматики асцита. Со дня начала болезни, опытной группе один раз в день делались инъекции личинок. Результатом испытания было увеличение среднего времени жизни особей опытной группы на 6,6 дней по сравнению с контрольной группой. Объем асцитной жидкости по сравнению с контрольной группой уменьшился в 14-16 раз. На основании исследования патологического процесса развития асцита было обнаружено, что развитие раковых клеток у особей опытной группы было замедлено и имелись очевидные регрессивные изменения. Красящая способность – плохая, количество ядер после деления – мало, многоядерные клетки – отсутствуют. Личинки трутня также содержат большое количество биологически активных компонентов, стимулирующих рост организма и компонентов, препятствующих его старению. Румынские лекарственные препараты, изготовленные с использованием личинок трутней, продемонстрировали хорошие результаты при лечении неврозов у взрослых и умственной отсталости у детей. Исследовательский институт пчеловодства Чжэцзянского аграрного университета, Ху Фулян и другие, совместно с Центром лабораторных животных Чжэцзянского института китайской традиционной медицины, Чэн Миньли и др., посредством подтверждения заметного улучшения сопротивляемости белых мышей стрессу и улучшению функции трансформации Т-лимфоцитов при использовании личинок и куколок пчелиной матки. Они также подтвердили сдерживающее действие, оказываемое на опухолевые клетки S180 [37-39]. Университет науки и технологии северного Китая, Чжоу Жухуа и другие, опытным методом подтвердили способность личинок пчелиной матки к усилению функций иммунной системы мышей [40]. Испытания на животных и клинические исследования лекарственной ценности пчелиных куколок подтверждают наличие следующих положительных свойств: 1. Поддержание здоровья головного мозга, улучшение умственных функций. Заметное улучшение памяти. Повышение эффективности работы мозга. 2. Препятствование гипоксии, повышение выносливости, снятие усталости. Улучшение скоростных и силовых характеристик организма, усиление сопротивляемости стрессу, тонизирование, активизацию скрытого жизненного потенциала. 3. Стимуляция регенерации нервных клеток, клеток печени, почек и других органов, что способствует обновлению организма. Регулирование работы вегетативной системы и метаболизма. Снижение уровня липидов, сахаров, холестерина и, как следствие, предупреждение заболеваний сосудов сердца и головного мозга. Профилактика сахарного диабета и ожирения печени. Способность к излечению множества видов заболеваний, связанных с нарушением метаболизма. Повышение иммунитета, в особенности усиление способности клеток к регенерации. Замедление старения, продление жизни. 4. Питание и оздоровления лица и тела [9].
1.4 Существующие проблемы и источники личинок трутней в нашей стране
Наша страна является самой большой пчеловодческой страной. Она находится на первом месте в мире по количеству пчелиных роёв. Это даёт преимущество в исследованиях, производстве, разработке и использовании личинок и куколок медоносных пчёл, так как это натуральный продукт, производимый роем. Превосходство в исследовании, производстве, разработке и использовании личинок и куколок медоносных пчёл. Широкие перспективы развития. Организация производства личинок и куколок трутней имеет широкие перспективы развития и зачастую требует чёткого планирования. Если каждый рой способен производить по одной гнездовой рамке (при объёме каждой рамки в 0,6 кг), то годовая производительность составит более 4000 тонн. Очевидно, что производство личинок и куколок медоносной пчелы не только имеет хороший потенциал, но и очень широкие перспективы развития [6, 7]. Однако, на сегодняшний день, в нашей стране существует много проблем связанных с использованием и производством куколок трутней. Основные из них следующие: малые объёмы производства; не высокая производственная активность пасечников; несовершенство методов хранения и сохранения свежести; рынок куколок трутней находится на этапе их экспорта в форме сырья. Всё это требует от нас ещё более продуктивного развития данной сферы и проведения соответствующих исследований. Как следствие – стимулирование развития пчеловодства и промышленности по переработке сельхозпродукции.
1.5 Суть исследования изложенного в данной диссертации
Хотя одновременно с увеличением спроса на «зелёные» пищевые продукты, познания в области старения организма и способов поддержания его здоровья за последние несколько лет углубились, а роль продукции пчеловодства в процессе противостояния раку и другим заболеваниям получила огромную предрасположенность людей, однако не важно от того за границами, или в пределах нашей страны, основными проблемами все также являются поверхностное отношение к развитию и использованию личинок и куколок медоносных пчёл, а также недостаточность внимания уделяемого обработке продукции. В совокупности, эти проблемы привели к тому, что активные вещества, содержащиеся в куколках и личинках медоносных пчёл, не могут быть должным образом сохранены и, как следствие, усвоены человеческим организмом для последующего их использования. Большая часть вопросов осталась неисследованной и неиспользованной. Особенно это касается потенциального увеличения источников сбора сырья за счёт развития технологий содержания пчёл. Помимо этого, также не хватает проведения систематических испытаний на животных. Появляется всё больше и больше информации о таких функциях личинок и куколок медоносных пчёл как снятие усталости, усиление иммунитета, замедление старения и противостояние развитию опухолей, однако большая часть из них относится к личинкам пчелиной матки, информации же о личинках и куколках трутней очень мало. Кроме этого, важными проблемами также являются нечёткое описание или не подтверждённые предположения, сделанные на основе активных свойств отдельных питательных компонентов. Информации об испытаниях фармакологических свойств ещё меньше. Кроме того, в имеющейся информации не рассматривается фармакологическое воздействие всесторонне, а лишь представлены результаты испытаний его свойств по снятию усталости, замедлению старения, либо повышению иммунитета. Всё это приводит к недостаточности систематических обоснований для проведения исследований и развития такого драгоценного продукта. Поэтому задачей данной диссертации стало использование традиционных систематических испытаний и оценок таких свойств личинок трутней, как снижение усталости и повышение иммунитета, их сочетания с методиками традиционной медицины и получения рецептуры препарата, сочетающего в себе как личинки трутней, так и лекарство китайской медицины. Одновременно с этим были выполнены исследования, направленные на определение наилучшего соотношения этих компонентов, что в свою очередь дало надёжную справочную информацию для применения препарата в клинических условиях.
1.6 Проблемы оставшиеся нерешёнными
По причине ограниченности временных и человеческих ресурсов, у меня не было возможности провести испытания на определение других оздоровительных функций личинок трутней. Также не было возможности изложить обоснования, касательно механизмов действия по взаимному дополнению друг друга личинок трутней и лекарства китайской медицины. Направлением будущих исследований является исследование механизмов действия компонентов, опираясь на более глубокое понимание их функций, проведение аналитического отбора активных компонентов, и их обработка с целью получения препарата с ещё лучшими лечебными свойствами.
2 Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Личинки трутней (в данном документе это в частности указывает на личинки возрастом 10 дней): предоставлены Хуан Хаяцянем из провинции Чжецзян, уезда Синьчан
2.1.2 Лекарство китайской медицины: Приобретено у Фучжоуской компании занимающейся сырьём для изготовления лекарств
2.1.3 Испытуемые животные
2.1.3.1 Куньминские мыши, самцы, вес: 20-22 г. Класс животных: обычный; Сертификат соответствия YiDongZi №002-04 (прим. перев.: номер по классификатору медицинских животных), место приобретения: Фучжоу, эпидемиологическая станция, центр по выращиванию животных.
2.1.3.2 Здоровый петух. Вес: 1,8 кг, место приобретения: Фучжоу, эпидемиологическая станция, центр по выращиванию животных.
2.1.3.3 Морская свинка. Вес: 190-250г, место приобретения: Фучжоу, эпидемиологическая станция, центр по выращиванию животных.
2.2 Реагенты, применяемые в испытаниях |
||||
| Серная кислота (высокого качества) | Город Шанхай, Химзавод Чжэнсин № 1 (Shanghai Zhenxing Chemcial Factory No.1) | |||
| Раствор Гимза | ООО «Реагенты САНЬАЙСЫ», г. Шанхай (Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.) | |||
| Раствор Райта | ООО «Реагенты САНЬАЙСЫ», г. Шанхай (Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.) | |||
| Эозин Y | ООО «Реагенты САНЬАЙСЫ», г. Шанхай (Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.) | |||
| Циклофосфамид (используется для инъекций) | ООО «Фармацевтика ХУАЛЯНЬ», г. Шанхай (SHANGHAI HUA LIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD) | |||
| Трансформирующий раствор | Исследовательский институт ЧЖУНШАНЬ, г. Тяньцзинь | |||
| Стандартный цианметгемоглобин | ООО «Медицина и медтехнологии ИХУА», г. Шанхай (Shanghai Yihua Medical Science & Technology Co., Ltd) | |||
| DNFB | E. Merck Darmstadt | |||
| Набор реагентов – лактатдегидрогеназа | ООО «Биотехнологии ЖУНШЭН», г. Шанхай (SHANGHAI RONGSHENG BIOTECH CO.,LTD) | |||
| Набор реагентов – азот мочевины крови (BUN) | ООО «Биотехнологии ЖУНШЭН», г. Шанхай (SHANGHAI RONGSHENG BIOTECH CO.,LTD) | |||
| Все остальные стандартные реагенты – отечественного производства, аналитически чистые. | ||||
2.3 Используемое измерительное оборудование |
||||
| Термостатическая водяная баня с электроподогревом, модель HWS 12 | Электронные аналитические весы, модель AE 200S | |||
| Кислотомер, модель PH 211 | Спектрофотометр 722 | |||
| Многофункциональный высокоскоростной гомогенизатор с функцией контроля температуры | Лиофилизатор, модель LGJ 1.5 | |||
| Водяная баня-шейкер, модель SHA-C | Центрифуга BECKMAN, модель J2-MC | |||
| Центрифуга Eppendorf 5804 (R) | Электронный микроскоп | |||
| Многофункциональный пищевой миксер | Инкубатор с функцией поддержания постоянной температуры | |||
2.4 Метод проведения испытания
Определение влагосодержания производится согласно требованиям «Методов санитарной проверки продуктов питания» [41], изданных министерством здравоохранения КНР. Пищевая безопасность и оценка функциональности проводится согласно процедуре оценки функциональности питательных продуктов и методов их проверки [42-43].
Расчёт дозировки производится по 100%-му сухому весу.
2.4.1 Определение содержания влаги
2.4.1.1 Определение содержания влаги в личинках трутней
Приготовление реагентов:
Соляная кислота, концентрацией 6 моль/л: отмерить 100 мл соляной кислоты, разбавить водой до постоянного объёма в 200 мл;
Раствор гидроксида натрия, концентрацией 6 моль/л: отвесить 24 г гидроксида натрия, разбавить его до постоянного объёма в 100 мл;
Морской песок: Речной песок промыть от грязи, затем проварить его в 6-мольной соляной кислоте на протяжении 30 минут. Промыть песок в воде до его нейтрализации, затем проварить в 6-мольном растворе гидроксида натрия 30 минут. Промыть водой до нейтрализации и высушить при температуре 105°С.
Взять чистую выпарную чашу, положить внутрь 10 грамм морского песка и маленькую стеклянную палочку. Поместить чашу внутрь сушильной камеры, разогретой до 105°C. Сушить при постоянной температуре на протяжении 30 минут, затем достать и поставить в сушилку на 30 минут для остывания. Взвесить. Повторять данную процедуру до достижения постоянного веса. После этого точно отвесить определённое количество мелко измельчённых личинок трутней и поместить их в выпарную чашу. При помощи маленькой стеклянной палочки равномерно перемешать содержимое чаши и поставить её на кипящую водяную баню для выпаривания жидкости непрерывно помешивая. Вытереть капли влаги на дне чаши, поместить чашу в сушилку и сушить на протяжении 4 часов при температуре 105°C. После этого закрыть чашу, достать её из сушильной камеры и поместить в сушилку на 30 минут для охлаждения. Взвесить и снова поместить в сушилку на 1 час. Сушить при температуре 105°C. После этого, накрыть крышкой, достать из камеры и поместить в сушилку на 30 минут для охлаждения, затем взвесить чашу повторно. Повторять данную процедуру до того момента, пока разница между последними двумя взвешиваниями не будет ниже 2 мг. При разнице меньше 2 мг, вес можно считать постоянным.
2.4.1.2 Определение влажности лекарства китайской медицины
Взять чистую плоскую стеклянную бюксу. Поместить её в сушильную камеру с температурой 105°C. Расположить крышку наклонно так, чтобы она опиралась на край бюксы. Нагревать на протяжении 1 часа. Закрыть крышку, достать бюксу из сушильной камеры и поместить в сушилку на 30 минут для охлаждения. Взвесить. Повторять процедуру сушки до установления постоянного веса. Отвесить порошкообразный лекарство китайской медицины и поместить его в бюксу. Высота насыпи образца должна быть около 5 мм. Закрыть крышку. После точного взвешивания поместить бюксу в сушильную камеру с температурой 105°C. Расположить крышку наклонно так, чтобы она опиралась на край бюксы. После сушки на протяжении 4 часов закрыть крышку, достать бюксу и поместить её в сушилку на 30 минут для охлаждения. Взвесить и снова поместить в сушилку на 1 час. Сушить при температуре 105°C. После этого, накрыть крышкой, достать из камеры и поместить в сушилку на 30 минут для охлаждения, затем взвесить чашу повторно. Повторять данную процедуру до того момента, пока разница между последними двумя взвешиваниями не будет ниже 2 мг. При разнице меньше 2 мг, вес можно считать постоянным.
2.4.2 Испытание на пищевую безопасность
2.4.2.1 Испытание на острую токсичность
Определение LD50 по методу Хорна с заданными дозировками; Определение острой токсичности при сочетании смеси личинок трутней и лекарства китайской медицины, определение LD50 по методу Хорна с заданными дозировками. Значение LD50 определяется по таблице.
Выбрать 4 дозировки личинок трутня и лекарства китайской медицины: 10, 21,5, 46,4, 100,0 г/кг. Одна группа состоит из 5 мышей. Испытание проводится раздельно для самцов и самок. Каждой мыши даётся образец по 0,8 мл за 1 раз. Необходимая дозировка должна быть набрана равномерно на протяжении 24 часов. В совмещённом опыте острой токсичности соотношение личинок трутней и лекарства китайской медицины составляет 1:1. Дозировки выбираются согласно испытанию отдельного образца.
2.4.2.2 Испытание на генотоксичности
2.4.2.2.1 Микроядерный тест костного мозга
Принцип: микроядро – это определённая форма проявления повреждения хромосомы. Они появляются вследствие изменений сегментов хромосомы, оставшихся после её разрыва. После того, как хромосома получает повреждение и теряет свои сегменты, то после наступления телофазы, она исключается дочерней клеткой и формируется микроядро, находящееся вне цитоплазмы. В интерфазной клетке, оно превращается в одну, или несколько структур круглой формы. Размер микроядра гораздо меньше размера ядра обычной клетки и составляет примерно 1/20 – 1/5 диаметра эритроцита. Отсюда и произошло его название – микроядро. В костном мозге, незрелые эритроциты без ядра (полихроматические эритроциты (PCE)) находятся в достаточном количестве. Микроядра могут быть легко различимы в плазме, к тому же стихийность отношения количества микроядер довольно низка. Поэтому изменение количества микроядер в костном мозге животных это один из методов определения мутагенной активности в организме подопытного.
Животные, используемые для испытания: куньминская мышь, вес 25-30 грамм. В одной группе 5 особей. Испытание производится раздельно для самцов и самок.
Порядок проведения испытания:
Приготовление реагентов:
Сыворотка крови мыши: после проведения бактериологической фильтрации сыворотки крови мыши, она помещается на водяную баню с температурой 56°C на 60 минут для инактивации. Затем, отправляется на хранение в холодильник с температурой 4°C.
Раствор Гимза для хранения: отвесить 3,8 грамма красителя Гимза, добавить 175 мл метилового спирта и перетереть. После полного растворения красителя добавить 125 мл глицерина. Поместить ёмкость в термостат с температурой 37°С на 48 часов, иногда встряхивая. После фильтрования на протяжении двух недель оставить про запас.
Рабочий раствор Гимза: взять одну часть раствора Гимза приготовленного для хранения и смешать с 6 частями фосфатного буферного раствора. Смешивать непосредственно перед применением;
Фосфатный буферный раствор концентрацией 66,7 ммоль/л (pH6,8): Взять 4,5 грамма дигидроортофосфата калия (KH2P04) и 11,80 г двузамещенного кислого фосфорнокислого натрия (Na2HP04·12H20). Добавить дистиллированной воды до достижения объёма 1000 мл. Равномерно перемешать.
Приготовление образца: устанавливаются 4 группы дозировок: 1 г/кг, 5 г/кг, 10 г/кг и 20 г/кг. Негативный контроль – дистиллированная вода и положительный контроль – циклофосфамид (CP) 40 мг/кг веса. Используя метод орального введения, образец даётся дважды с промежутком в 24 часа. Через 6 часов после второго введения образца, умертвить животное, свернув ему шею. Извлечь грудную кость. При помощи кровоостанавливающего зажима извлечь костный мозг и равномерно смешать его на стеклянной пластинке с сывороткой крови мыши. Способ нанесения слоя – стандартный. После естественного высыхания слоя на пластинке, опустить её в метиловый спирт на 10 минут. После этого в тот же день отложить на хранение. На следующий день положить пластинку в рабочий раствор Гимза на 10 минут для окрашивания. Затем сразу же ополоснуть пластинку фосфатным буферным раствором с кислотностью 6,8 и просушить.
Анализ пробы: через масляно-имерсионный объектив отобрать участки с целыми клетками, равномерной дисперсией и правильным окрашиванием. Посчитать их согласно определённого порядка. Подсчитать количество полихроматических эритроцитов (PCE сине-серого цвета) и клеток с микроядрами (MNPCE). Всего подсчитывается 1000 штук. Для каждой из мышей подсчитать тысячную долю микроядер (хромофильность идентична нуклеоплазме, может быть фиолетово-красная, либо сине-фиолетовая). Также необходимо подсчитать отношение P/N количества полихроматических эритроцитов (PCE, сине-серого цвета) и зрелых эритроцитов (RBC, розово-красного цвета). Если данное соотношение больше, либо равно 1, то это считается нормой. Значение меньше 1 означает, что образец токсичен для клеток костного мозга испытуемого.
2.4.2.2.2 Тест на аберрацию сперматозоидов у мышей.
Принцип: Аберрация сперматозоидов мыши контролируется генами. Она имеет высокую наследственность. Множество генов эухромосом и X и Y-хромосом косвенно, либо непосредственно определяют состояние сперматозоидов. Аберрация сперматозоидов в основном указывает на то, что состояние сперматозоидов отклонено от нормы (аномально). Понимание того, что присутствует Аберрация сперматозоидов означает, что произошла мутация гена, обеспечивающего их формирование. Поэтому, изменение состояния сперматозоида говорит о том, что соответствующие ген и продукт белка мутировали. Тест на аберрацию сперматозоидов у мышей позволяет определить влияние факторов окружающей среды на формирование и рост сперматозоидов, а также то, что известные генеративные клетки обладают высокой чувствительностью к данному мутагену. На основании данного исследования, можно определить, оказывают ли факторы внешней среды мутагенное воздействие на генеративные клетки.
Приготовление основных реагентов: 1-2%-й краситель эозин: отвесить 1-2 грамма эозина и растворить в 100 мл дистиллированной воды.
Испытуемые животные: идентично пункту 2.4.2.2.1.
Порядок проведения испытания:
Подготовка образцов для испытания: подготовить группу для отрицательного контроля (дистиллированная вода), группу для положительного контроля (50 мг/(кг*d) циклофосфамида) и 4 исследуемые группы (дозировки: 1 г/кг, 5 г/кг, 10 г/кг и 20 г/кг).
Образец вводится через рот. Время непрерывного употребления образца: 5 дней. Через 35 дней после завершения введения образцов мышей следует умертвить. Извлечь оба семенника, поместить в маленький стакан с 1 мл физиологического раствора. При помощи офтальмологических ножниц на семенниках сделать 1-2 продольных разреза. Оставить на 3-5 мин. Легонько потрясти. Отфильтровать при помощи бумаги для протирки оптических стёкол сложенной в четыре раза. Пипеткой собрать жидкость и нанести тонким слоем на стеклянную пластинку. После высушивания пластинки на воздухе, закрепить метиловым спиртом на протяжении 8 минут. Высушить в естественных условиях. Выполнить окрашивание 1-2%-м эозином на протяжении 1 часа. Промыть дистиллированной водой. Высушить.
Микроскопическое исследование: При помощи объектива с малым увеличением и зелёного светофильтра найти чистое место, в котором можно хорошо увидеть отдельные сперматозоиды.
Провести анализ состояния сперматозоидов при помощи объектива с большим увеличением. Подсчитать и записать количество сперматозоидов с нормальной морфологией. Сперматозоиды с головкой, но без жгутика (контур не чёткий), либо сперматозоиды, у которых головка слиплась с другими сперматозоидами либо их частями, либо сперматозоиды, которые были разрезаны случайно при проведении теста – не учитываются. Для каждого животного проверяется как минимум 1000 сперматозоидов. Сперматозоиды с аномальным строением в основном отличаются специфическим строением головки, и вторично – строением жгутика. Такие сперматозоиды могут быть изогнутой формы, с аномально большой головкой, с нестандартной формой, с поломанным жгутиком, с двумя головками, с двумя жгутиками и т.д. Подсчитать процент аномальных сперматозоидов.
2.4.3 Испытание на сопротивление усталости и стрессу
2.4.3.1 Испытание на сопротивление усталости
2.4.3.1.1 Испытание плаванием
Принцип: повышение выносливости к физическим нагрузкам – это явная демонстрация усиления сопротивляемости усталости. Длительность времени плавания позволяет отразить степень сопротивляемости животного физическим нагрузкам.
Лабораторное оборудование: ванна для плавания (примерные размеры: 50см×50см×40см).
Дозировки: десять групп: 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 3,0, 5,0, 7,0, 9,0, 11,0 г/кг, дистиллированная вода. В каждой группе по 10 мышей.
Порядок проведения испытания: непрерывно, на протяжении 28 дней мышам даётся образец. Через 30 минут после введения последнего образца, мышь помещается в ванну для плавания. Глубина воды в ванне должна быть не меньше 30 см. Температура воды: 25°C±0.5°C. К основанию хвоста мыши прикрепляется свинцовая пластинка с весом равным 5% от массы тела мыши. Фиксируется время с момента помещения мыши в воду до её смерти. Это время будет считаться временем плавания мыши (сек.).
2.4.3.1.2 Испытание с удержанием на жерди
Принцип: повышение выносливости к физическим нагрузкам – это явное проявление усиления сопротивляемости усталости. Длительность времени удержания за жердь позволяет отразить степень выносливости животного при статических физических нагрузках.
Материалы: жердь с опорой, диаметр 1 см, длина около 25 см. Форма и материал жерди: жердь круглого сечения из органического стекла (отполированная наждачной бумагой с зернистостью 120). Верхний конец жерди закреплён на деревянной доске. Нижний конец находится на расстоянии 20 см от поверхности земли.
Дозировки: идентично пункту 2.4.3.1.1.
Порядок проведения испытания: во время проведения испытания, жердь располагается в тазу с водой. Температура воды: 15°C, глубина: 10 см. Непрерывно, на протяжении 28 дней мышам даётся образец. Через 30 минут после введения последней дозы образца начинается испытание. Мышь размещается на жерди из органического стекла. Мышцы мыши должны быть в статически сокращённом состоянии. Фиксируется время между моментом размещения мыши на жерди и её падения вследствие мышечной усталости. После третьего падения мыши испытание считается завершённым. Окончательным временем считается сумма зафиксированных отрезков времени для каждого из трёх испытаний.
2.4.3.1.3 Измерение количества молочной кислоты в крови
Принцип: накопление молочной кислоты в организме – это главный фактор, влияющий на появление усталости. Посредством определения содержания молочной кислоты в крови животного после получения физической нагрузки можно определить состояние метаболизма молочной кислоты и как следствие проанализировать способность организма к анаэробному и аэробному метаболизму. При катализации ионов меди, в кипящей воде, между молочной кислотой и концентрированной серной кислотой происходит реакция. Молочная кислота превращается в уксусный альдегид. Производным веществом, образующимся вследствие реакции уксусного альдегида с парагидроксифенилом является химическое соединение фиолетового цвета. При длине волны 560 нм, оно интенсивно поглощает свет. Таким образом возможно проведение количественного измерения.
Дозировки: пять групп: 1,0, 3,0, 5,0, 7,0 г/кг и дистиллированная вода в качестве контрольной группы. В каждой группе по 10 мышей.
Порядок проведения испытания:
Приготовление реагентов:
Осадитель белка: в зависимости от объёма, взять одну часть 10%-го вольфрамата натрия, одну часть серной кислоты с концентрацией 1/3 моль/л, и смешать их с 28-ю частями дистиллированной воды.
Смесь осадитель-NaF: в зависимости от объёма взять 4 части осадителя и смешать его с одной частью 1%-го раствора фтористого натрия (NaF).
Раствор 5%-го парагидроксифенила: отвесить 1,5 грамма парагидроксифенила и растворить его в 100 мл горячего 0,5%-го гидроксида натрия (NaOH).
Заготовленная жидкость – стандартная молочная кислота (1 мг/мл): отвесить 106,6 мг лактата лития, либо 171 мг лактата кальция. Растворить его в 10%-й трихлоруксусной кислоте до объёма 100 мл.
Рабочая жидкость – стандартная молочная кислота (0,01 мг/мл): точно отмерить 1,0 мл заготовленной жидкости – стандартной молочной кислоты (1 мг/мл). Разбавить её до объёма 100 мл (приготовленная жидкость должна быть сразу же использована).
Подготовка образца: непрерывно, на протяжении 28 дней мышам даётся образец. Через 30 минут после введения последнего образца к мыши крепится груз весом 2% от массы тела, и она помещается в плавательный бассейн с температурой 30°C на 60 минут. Через 15 минут нахождения мыши в покое, производится забор крови из глазного яблока.
Порядок действий: в пробирку ёмкостью 5 мл набирается 0,48 мл 1%-го раствора фтористого натрия. Точно отобрав 20 мкл крови, она помещается на дно пробирки. Чистой жидкостью из верхней части пробирки промыть микропипетку несколько раз, после чего добавить 1,5 мл осадителя белка. Взболтать пробирку для равномерного перемешивания. Поместить пробирку в центрифугу на 10 минут, при скорости её вращения равной 3000 об/мин. Отобрать надосадочную жидкость и выполнять действия согласно таблице ниже:
| Пустая пробирка (мл) | Стандартная пробирка (мл) | Пробирка для испытаний (мл) | |
| Смесь осадитель-фтористый натрий (NaF) | 0,5 | — | — |
| Рабочая жидкость – стандартная молочная кислота | — | 0,5 | — |
| Надосадочная жидкость | — | — | 0,5 |
| 4%CuS04 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Концентрированная серная кислота | 3,0 | 3,0 | 3,0 |
| Равномерно перемешать и поместить в кипящую водяную баню для нагрева на 5 мин. После извлечения, поместить её в ледяную баню для охлаждения на 10 минут. | |||
| Раствор 5%-го парагидроксифенила | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
После завершения выполнения действий, приведённых выше, равномерно взболтать и поместить в водяную баню с температурой 30°C на 30 минут. (взбалтывать каждые 10 минут). После извлечения пробирок из водяной бани, поместить их в водяную баню с кипящей водой на 90 секунд, для нагрева. После извлечения охладить в проточной воде до комнатной температуры. Выполнить колориметрию при длине волны 565 нм. Пустая пробирка принимается за ноль.
2.4.3.1.4 Определение азота мочевины сыворотки крови: метод GLDH
Принцип: мочевина + H20 → уреаза → 2HNO3 + CO2
2NH3+a-кетоглутаровая кислота + NADH →(глутаминопировиноградная трансаминаза) → глютаминовая кислота + NAD+ + H2O
Содержание мочевины рассчитывается посредством сравнения скорости падения степени поглощения света для NADH и для стандартной жидкости приготовленной аналогичным способом, в условиях освещения с длиной волны 340 нм.
Дозировки: Идентично пункту 2.4.3.1.1.
Состав реагентов: R1: Tris100 ммоль/л, a-кетоглутаровая кислота 5ммоль/л, дегидрогеназа глютаминовой кислоты >140 ед./мл, уреаза >140 ед./мл, PH8.0; R2: NADH3,1 ммоль/л
Параметры испытания:
| Температура | Длина волны: | Время задержки | Количество использованного образца | Количество использованной жидкости | Измеренной время |
| 37°C | 340 нм | 30 сек. | 10ul | 1000ul | 60 сек. |
Порядок проведения испытания:
Подготовка образца: непрерывно, на протяжении 28 дней мышам даётся образец. Через 30 минут после введения последнего образца, после плавания в бассейне с температурой воды 30°C на протяжении 90 минут, производится забор крови и изготавливается сыворотка крови.
Подготовка рабочей жидкости: смешать 4 части реагента R1 и 1 часть реагента R2. Действия выполняются согласно приведённой ниже таблицы:
| Пробирка с образцом (S) | Калибровочная пробирка (CAL) | ||
| Калибровочная жидкость | (мкл) | – | 10 |
| Образец | (мкл) | 10 | – |
| Рабочая жидкость | (мкл) | 1,0 | 1,0 |
После равномерного перемешивания, произвести колориметрию при помощи спектрофотометра (необходимо заранее выставить нулевую точку используя дистиллированную воду при световом излучении с длиной волны 340 нм).
Раздельно зафиксировать показания прибора через 30 секунд (A1) и через 90 секунд (A2).
2.4.3.1.5 Определение лактатдегидрогеназы: (L-P) метод
Принцип: есть три пути метаболического выведения молочной кислоты, производимой во время физической нагрузки. Первым этапом выведения является реакция по трансформации молочной кислоты в пировиноградную кислоту. Этот этап общий для всех трёх путей выведения. Данный этап проходит при катализе лактатдегидрогеназы. Поэтому повышение активности лактатдегидрогеназы позволяет ускорить вывод накопленной в крови и мышцах молочной кислоты. Таким образом позволяет замедлить наступление, либо ускорить снятие усталости. Лактатдегидрогеназа катализирует окисление молочной кислоты до пировиноградной кислоты. Одновременно с этим восстанавливая NAD до NADH. Активность лактатдегидрогеназы в образце может быть получена посредством измерения скорости повышения светопоглощающей способности при длине волны 340 нм.
L-молочная кислота + NAD+ LDH пировиноградная кислота + NADH + H+
Состав реагентов: R1:NAD6,5 ммоль/л, хлористый калий 150 ммоль/л; R2: Tris100,0 ммоль/л, молочная кислота 50 ммоль/л (PH8,9).
Дозировки: идентично пункту 2.4.3.1.4.
Параметры испытания:
| Температура | Оптическая длина пути | Длина волны | Контрольное измерение |
| 37°C | 1 см | 340 нм | Вода, воздух |
Порядок проведения испытания:
Приготовление рабочей жидкости: R1:R2=4:1.
Приготовление образца: идентично пункту 2.4.3.1.4.
Порядок проведения испытания: взять 50 мкл образца, 1000 мкл рабочей жидкости и после перемешивания на протяжении 1 минуты, снять показания значения степени светопоглощения (A) через 1, 2 и 3 минуты.
2.4.3.1.6 Определение гликогена печени: метод с антрононом
Принцип: гликоген печени является источником энергии организма при выполнении физической работы. Достаточное количество запасённого гликогена печени, увеличивает количество получаемой организмом энергии и, как следствие, повышается выносливость. В случае, если некий функциональный пищевой продукт способен увеличить количество запасаемого гликогена печени, то это позволяет более эффективно поддерживать необходимый уровень сахара в крови во время выполнения физической работы, обеспечивая организм большим количеством энергии для сопротивления усталости. Антронон может вступать в реакцию со свободными сахарами, либо полисахаридами. После прохождения реакции, получившийся раствор имеет сине-зелёный оттенок и максимально поглощает свет при длине волны 620 нм. Измерив его оптическую плотность можно определить содержание гликогена.
Дозировки: идентично пункту 2.4.3.1.3.
Порядок проведения испытания:
Приготовление реагентов:
5%-я трихлоруксусная кислота (используется для приготовления дистиллированной воды) (TCA);
Антронон: в растворе содержится 0,05%-й антронона и 1%-й тиокарбамид. Приготавливается с использованием 72%-й H2SO4;
- Приготовление 72%-й H2SO4: в колбу налить 280 мл дистиллированной воды и 720 мл концентрированной серной кислоты (удельный вес: 1,84);
- Метод приготовления реагента – антронона: когда температура H2SO4 уменьшится до 80-90°C, добавить 500 мг чистого антронона и 10 г тиокарбамида высокой степени чистоты. Взболтать колбу до полного смешения компонентов.
Подготовка образцов: непрерывно, на протяжении 28 дней мышам даётся образец. Через 30 минут после введения последнего образца и после плавания в бассейне с температурой воды 30°C на протяжении 90 минут, мышь сразу же умерщвляется. Извлекается печень, омывается физиологическим раствором, и лишняя влага впитывается при помощи фильтровальной бумаги. Точно отвешивается 200 мг печени, добавляется 4 мл трихлоруксусной кислоты. Содержимое каждой колбы гомогенизируется на протяжении 1 минуты. Гомогенат помещается в центрифужную пробирку и выполняется отделение осадка на протяжении 15 минут, при скорости центрифуги 3000 об/мин. Надосадочная жидкость переливается в другую пробирку. В осадок добавить 4 мл трихлоруксусной кислоты, гомогенизировать на протяжении 1 минуты и ещё раз центрифугировать на протяжении 15 минут. Отобрать надосадочную жидкость и смешать её с надосадочной жидкостью полученной после первого центрифугирования.
Взять 1 мл надосадочной жидкости и налить её в центрифужную пробирку (для каждого образца сделать по два каллиматора для гарантирования того, что получен точный результат). В каждую из пробирок налить по 4 мл 95%-го этилового спирта, равномерно перемешать до исчезновения границы между двумя жидкостями. Закрыть чистой пробкой и оставить на ночь в вертикальном положении при комнатной температуре. После полного осаждения, поместить пробирку в центрифугу. Скорость вращения: 300 об/мин, время вращения: 15 минут. Осторожно слить надосадочную жидкость и оставить пробирку в перевёрнутом положении на 10 минут.
Разбавить гликоген 2 мл дистиллированной воды. Во время наливания воды смыть гликоген с краёв пробирки и потрясти пробирку для полного растворения гликогена.
Приготовление пробирки без реагента и стандартной пробирки:
Пробирка без реагента: взять 2 мл дистиллированной воды и налить её в чистую центрифужную пробирку.
Стандартная пробирка: взять 0,5 мл стандартной жидкой глюкозы (содержание глюкозы 100 мг/дл) и 1,5 мл дистиллированной воды, налить обе жидкости в одинаковые пробирки.
Определение содержания гликогена в образце:
Налить по 10 мл реагента антронона в пробирки. Жидкость (реагент – антронон) наливается непосредственно в центр пробирки, для гарантирования полного смешивания. Начиная с момента наливания антронона в пробирку, пробирка помещается под холодную проточную воду из крана для охлаждения. После того, как температура всех пробирок будет равна температуре холодной водопроводной воды, поместить пробирки в кипящую баню (глубина воды в бане немного выше уровня жидкости в пробирке) на 15 минут. Затем переместить пробирки в холодную ванну для их охлаждения до комнатной температуры. Перелить жидкость из пробирки в колориметрические пробирки, и после установки нуля при помощи пробирки без реагента при длине волны 620 нм, определить светопоглащающую способность.
2.4.3.2 Испытание на стрессоустойчивость
2.4.3.2.1 Испытание на сопротивление низким температурам
Принцип: организм, находясь в холодной среде, посредством увеличения количества производимого тепла, снижения количества рассеиваемого тепла, либо другими способами старается поддерживать относительно стабильную температуру тела. Однако, если температура слишком низка, то это приведёт к утрате способности гипоталамуса к терморегуляции, сдерживая тем самым количество производимого тепла клетками и препятствуя появлению дрожания от холода. В конечном итоге, это приведёт к смерти по причине регуляторной дисфункции центральной нервной системы.
Дозировки: идентично пункту 2.4.3.1.1.
Порядок проведения испытания: мышам даётся образец на протяжении 14 дней, через 30 минут после употребления мышью последнего образца, она помещается в отдельную клетку, которая ставится в холодное место с температурой окружающей среды -4°C. Фиксируется время смерти мыши (сек.).
2.4.3.2.2 Испытание на сопротивление высоким температурам
Принцип: высокая температура может заставить организм находится в экзальтированном состоянии, вызывая полное истощение коры надпочечников. В случае, если испытуемый препарат может повысить способность организма к сопротивлению высоким температурам, то это будет способствовать восстановлению надпочечников от истощения.
Дозировки: идентично пункту 2.4.3.1.3.
Порядок проведения испытания: мышам даётся образец на протяжении 14 дней, через 60 минут после употребления мышью последнего образца, она помещается в термостат с температурой окружающей среды 46°C. Фиксируется время смерти мыши (сек.).
2.4.4 Испытание иммунитета
2.4.4.1 Испытание неспецифической иммунной функции
2.4.4.1.1 Определение веса органов иммунной системы
Принцип: одновременно с увеличение возраста, органы иммунной системы (такие как тимус и селезёнка) постепенно деградируют и атрофируются. Наиболее выраженными являются изменения тимуса. Иммунный раздражитель может привести к увеличению веса органов иммунной системы по сравнению с контрольным образцом.
Дозировки: идентично пункту 2.4.3.1.3.
Порядок проведения испытания: мышам даётся образец на протяжении 28 дней, в последний день употребления мышью образца, она умерщвляется. Фиксируется вес тимуса и селезёнки.
2.4.4.1.2 Исследование фагоцитоза макрофагов
Принцип: в брюшную полость животного вводятся кровяные тельца курицы (CRBC), которые могут быть поглощены макрофагами. Через определённый период времени делается забор макрофагов из брюшной полости и при помощи микроскопа производится исследование их поглощающей активности. Процентное количество поглощённых клеток и показатели поглощения будут свидетельствовать о способности макрофагов к поглощению.
Дозировки: идентично пункту 2.4.3.1.3.
Порядок проведения испытания:
Приготовление реагентов:
Стерильный физиологический раствор: взять 0,9 г NaCL, добавить 100 мл воды и произвести стерилизацию на протяжении 10 минут под давлением 380 Па.
Фосфатный буфер (PB, pH6,4): взять 0,664 г KH2PO4 и 0,257 г Na2HPO4, добавить воды до достижения объёма в 100 мл.
Краситель Райта (Wright): взять 0,1 г порошка Райта и добавить к нему 160 мл метилового спирта. После полного растворения, перелить раствор в коричневую бутылку и оставить на хранение.
Краситель Гимза – Райта: взять 0,03 г порошка Гимза и 0,15 г порошка Райта. Оба компонента поместить в ступку. Добавить 1-2 капли глицерина и метилового спирта для достижения пастообразного состояния. Перетереть смесь в ступке. 50 мл метилового спирта разделить на маленькие порции и хорошенько промыть. Всю жидкость после промывки смешать в одной ёмкости, перелить в коричневую бутылку и оставить на хранение.
Рабочая жидкость Гимза – Райта – ФБ (PB – фосфатный буфер): Смешать краситель Гимза–Райта с фосфатным буфером (pH6,4) в пропорции 1:9.
Рабочая жидкость Хэнкса (Hanks): состоит из жидкостей типов А и Б;
Жидкость Хэнкса типа А: взять 160 г NaCL, 8г KCL, 2 г MgSO4•7H2O и MgCL2•6H2O, добавить 800 мл воды. Отдельно взять 2,8 г CaCL2 и растворить его в 100 мл воды. После смешивания двух жидкостей, добавить воды до объёма 1000 мл. Добавить 2 мл хлороформа для консервации. Поставить в холодильник с температурой 4°C на хранение.
Порядок проведения испытания:
В стерильных условиях, при помощи шприца произвести забор крови у здорового петуха из вены крыла. Поместить кровь в коническую колбу Эрленмейера, добавить раствор-антикоагулянт Альсевера. Набрать кровь петуха в центрифужную пробирку со шкалой 10 мл, добавить физиологический раствор и промыть три раза в центрифуге при скорости вращения равной 2000 об/мин (каждый раз центрифугировать по 5 минут). Полученную 5%-ю CRBC суспензию оставить на хранение. Перед использованием суспензии, вначале необходимо сделать мазок на стеклянной пластинке, высушить его, добавить 1 каплю красителя Райта и 9 капель рабочей жидкости-красителя Гимза-Райта-ФБ. Через 15 минут, смыть красители, высушить и при помощи микроскопа провести исследование на целостность клеток CRBC.
Кормить мышей на протяжении 28 дней. После употребления мышью последнего образца, ей в брюшную полость вводится 0,8 мл суспензии CRBC для стимулирования иммунной реакции. После введения суспензии, брюшко мыши необходимо легонько помассировать. Через 8 часов после введения суспензии, умертвить мышь свернув ей шею. В брюшную полость ввести 2,5 мл рабочей жидкости Хэнкса, помассировать брюшко, тем самым заставив раствор Хэнкса омыть макрофаги, находящиеся в брюшной полости.
В центре живота мыши выполнить маленький надрез. При помощи пипетки отобрать жидкость для промывки брюшной полости и нанести её на предметное стекло сформировав область размером 20см×15см. Эмалированный лоток простелить большим количеством слоёв марли. Смочить марлю физиологическим раствором, прижать и сверху положить стеклянную пластинку. Инкубировать при температуре 37°C на протяжении 30 минут. Затем, используя физиологический раствор смыть образовавшуюся на стеклянной пластинке белую плёнку из взвеси суспензии и непоглощённые красные кровяные тельца петуха. Высушить. Поместить в стеклянную ёмкость Коплина для окраски микропрепаратов с заранее набранным внутрь метиловым спиртом. Оставить стеклянную пластинку на 5 минут для затвердевания. Через 5 минут достать и обдуть холодным воздухом до полного осушения, затем снова выполнить окрашивание на протяжении 10 минут при помощи жидкости-красителя Гимза-Райта-ФБ. Смыть краситель дистиллированной водой и высушить.
На высушенную стеклянную пластинку капнуть одну каплю кедрового масла, провести наблюдение, используя масляно-имерсионный объектив, выделить 100 макрофагов и зафиксировать общее количество поглощённых CRBC в макрофагах, а также выделить 100 макрофагов, и зафиксировать среди них количество макрофагов, имеющих поглощённые CRBC.
2.4.4.2 Испытание клеточной иммунной функции
Динитрофторбензол (DNFB) вызывает у мышей гиперчувствительность замедленного типа (DTH)
Принцип: DNFB относится к гаптенам. После его разбавления и нанесения на кожу брюшка мыши, он прикрепится к кожному белку и образуется полный антиген. Полный антиген способен стимулировать T-лимфоциты, активно размножаться в форме сенсибилизированных лимфоцитов. Через 4-7 дней DNFB повторно наносится на кожу ушей и лапки мыши. Это вызовет локальную гиперчувствительную реакцию замедленного типа.
Дозировки: Идентично пункту 2.4.3.1.1.
Порядок проведения испытания:
Приготовление реагентов: 1%-й раствор DNFB: взять 50 мг DNFB и поместить в 5мл центрифужную пробирку с пробкой. Добавить 5 мл раствора ацетона и кунжутного масла (1:1), плотно закрыть крышку. Хорошо перемешать.
Порядок проведения испытания: мышам даётся образец на протяжении 28 дней. На 21 день, при помощи ножниц, на животе срезается шерсть в области 3 см × 3 см. Равномерно наносится 50 мкл раствора 1%-го DNFB, ацетона и кунжутного масла. Это вызовет иммунную реакцию, которая усилится на второй
день.
Через 5 дней, равномерным слоем нанести 50 мкл раствора 1%-го DNFB, ацетона и кунжутного масла на обе стороны правого уха мыши, тем самым нанеся удар по иммунитету. Через 24 часа умертвить мышь, свернув ей шею. Отрезать оба уха. При помощи дырокола сделать образцы левого и правого ушей диаметром 8 мм. Взвесить. Разница в весе образцов взятых с правого и левого ушей характеризует степень набухания. Рассчитать степень набухания.
2.4.4.3 Испытание гуморальной иммунной функции
Метод иммунной реакции на CRBC
Принцип: используя красные кровяные тельца петуха (CRBC) в качестве иммуногена, у обычной мыши вызывается иммунная реакция. Через неделю выработаются антитела к CRBC (гемолизин). Этот гемолизин вместе с CRBC и комплементом должны быть культивированы в теплоизоляционных условиях. Он может вызвать гемолиз CRBC, тем самым заставив его выпускать гемоглобин. Насыщенность его цвета зависит от количества гемолизированных эритроцитов. Измерение выполняется методом колориметрии. Значение степени абсорбции света используется для определения показателей гемолизина в сыворотке крови.
Дозировки: идентично пункту 2.4.3.1.3.
Порядок проведения испытания:
Приготовление реагентов:
Эмульсия CRBC: метод приготовления идентичен приведённому в пункте 2.4.4.1.2. Необходимо приготовить эмульсии с концентрацией 2% и 5%.
Сыворотка крови морской свинки: выполняется забор крови из сердца. Методом центрифугирования отделяется сыворотка крови и помещается в холодильник на хранение.
2.4.5 Исследования, направленные на определении более точной наилучшей дозировки личинок трутней.
2.4.5.1 Испытание плаванием
Дозировки: 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 и 5,5 г/кг. В каждой группе по 10 мышей.
Порядок проведения испытания: температура воды в бассейне для плавания 30°C. Всё остальное идентично пункту 2.4.3.1.1.
2.4.5.2 Испытание клеточной иммунной функции
Динитрофторбензол (DNFB) вызывает у мышей гиперчувствительность замедленного типа (DTH)
Дозировки: идентично пункту 2.4.5.1.
Порядок проведения испытания: идентично пункту 2.4.4.2.
2.4.6 Исследования, направленные на определение наилучшего соотношения компонентов смеси личинок трутней и лекарства китайской медицины
2.4.6.1 Испытание плаванием
Дозировки: Согласно занимаемой лекарством китайской медицины части (5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 50%) в смеси личинок трутней и лекарства китайской медицины формируются 8 групп испытуемых и одна контрольная группа, употребляющая только личинки трутня. Дозировка согласно 3 г препарата на 1 кг массы тела.
Порядок проведения испытания: идентично пункту 2.4.5.1.
2.4.6.2 Исследование клеточной иммунной функции
Динитрофторбензол (DNFB) вызывает у мышей гиперчувствительность замедленного типа (DTH)
Дозировки: идентично пункту 2.4.6.1.
Порядок проведения испытания: идентично пункту 2.4.4.2.
2.4.7 Исследования, направленные на определение наиболее подходящей дозировки смеси личинок трутней и лекарства китайской медицины
2.4.7.1 Испытание плаванием
Дозировки: при условии, что часть лекарства китайской медицины в смеси равна 30%, формируются 8 групп согласно следующим дозировкам: 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 и 5,0 г/кг.
Порядок проведения испытания: идентично пункту 2.4.5.1.
2.4.7.2 Испытание клеточной иммунной функции
Динитрофторбензол (DNFB) вызывает у мышей гиперчувствительность замедленного типа (DTH)
Дозировки: идентично пункту 2.4.7.1.
Порядок проведения испытания: идентично пункту 2.4.4.2.
2.5 Статистический метод
Применяется дисперсионный анализ с одним фактором. Производится статистическая обработка, попарно сравнивая испытуемые группы, либо группы положительного контроля с группами отрицательного контроля. Обработка данных производится с использованием программного обеспечения для статистического анализа SPSS10.0 для ОС Windows. Для определения корреляции, применяется корреляционный анализ. Символ «*» означает, что значимое различие присутствует при P<0,05. «**» означает, что значимое различие присутствует при P<0,01
